一、標準概述

硫氰酸根（Thiocyanate，SCN?）是生乳中需要重點監控的物質之一。它在自然界中天然存在，但更值得關注的是人為添加問題——不法分子將硫氰酸鈉（俗稱“保鮮劑"）摻入生乳中，利用其抑菌作用延長生乳的“保質期"，掩蓋生乳因儲存不當導致的變質問題。這種違規添加行為不僅損害了消費者健康，也嚴重擾亂了乳品市場秩序。

NY/T 3513-2019《生乳中硫氰酸根的測定 離子色譜法》 是由中華人民共和國農業農村部發布的一項農業行業推薦性標準。該標準于2019年12月27日發布，2020年4月1日正式實施。標準按照GB/T 1.1—2009給出的規則起草，由農業農村部畜牧獸醫局提出，由全國畜牧業標準化技術委員會（SAC/TC 274）歸口。

起草單位為中國農業科學院北京畜牧獸醫研究所、農業農村部奶產品質量安全風險評估實驗室（北京）、農業農村部奶及奶制品質量監督檢驗測試中心（北京）。主要起草人包括文芳、葉巧燕、鄭楠、李松勵、王加啟。標準總頁數為8頁，中國標準分類號為X16，國際標準分類號為67.100.10。

該標準規定了生乳中硫氰酸根測定的離子色譜法，適用于牛、羊、水牛、牦牛等不同奶畜生乳中硫氰酸根的測定。標準的檢出限為0.25 mg/kg，定量限為0.75 mg/kg。該標準經農業農村部公告第251號批準發布，目前狀態為現行有效。

二、方法原理

NY/T 3513-2019所采用的核心技術是離子色譜法（Ion Chromatography, IC），配備抑制器電導檢測器。其基本原理可概括為以下步驟：

第一步：蛋白沉淀——生乳中含有大量蛋白質和脂肪，直接進樣會嚴重污染色譜柱。試樣用乙腈沉淀蛋白，利用乙腈使乳蛋白變性析出。

第二步：稀釋與凈化——蛋白沉淀后的上清液加水稀釋，再經反相固相萃取小柱（如OnGuard II RP柱）凈化。反相小柱可有效去除提取液中的色素、脂肪、疏水性雜質等干擾物，保護色譜柱免受污染。

第三步：分離——凈化后的樣品溶液注入離子色譜系統，硫氰酸根離子在陰離子交換色譜柱上與其他共存陰離子（如氯離子、硝酸根、硫酸根等）實現分離。

第四步：檢測——分離后的硫氰酸根離子進入電導檢測器進行測定。電導檢測器對離子型化合物具有良好的響應特性，配合陰離子抑制器使用可顯著降低背景電導，提高檢測靈敏度。

第五步：定性與定量——以保留時間定性，試樣溶液中硫氰酸根的保留時間應與標準溶液一致，相對偏差在±2.5% 之內。以外標法定量，通過比較樣品峰面積與標準曲線計算樣品中硫氰酸根的含量。

這一方法的核心技術特點在于乙腈沉淀蛋白與反相固相萃取兩步凈化的組合設計。生乳基質極為復雜，蛋白質、脂肪、乳糖等成分均可能干擾離子色譜分析。乙腈沉淀可去除大部分蛋白質，反相小柱則可吸附脂肪和疏水性有機物，兩者協同作用確保了色譜柱的長期穩定運行和檢測結果的準確性。

三、試劑與材料

標準對實驗用試劑和材料有嚴格規定，這是保證檢測結果準確性的基礎。

用水要求：實驗用水應符合GB/T 6682規定的一級水。一級水是最高純度的實驗用水，電阻率通常不低于18.2 MΩ·cm，可有效避免水中本底離子對痕量硫氰酸根檢測的干擾。

試劑純度：除非另有規定，所用試劑均為分析純。其中乙腈、甲醇、丙酮、50%氫氧化鈉溶液等應為色譜純。試劑中若含有微量硫氰酸根或其他陰離子雜質，將直接影響空白值和檢測結果的準確性。

主要試劑：

淋洗液體系：標準提供了兩種淋洗液體系供選擇：

·         氫氧根系淋洗液：濃度45 mmol/L～60 mmol/L，可由儀器自動在線生成或手工配制。手工配制時，取2.34 mL（45 mmol/L）或3.12 mL（60 mmol/L）50%氫氧化鈉溶液，用水稀釋至1000 mL。可通入氮氣保護以減緩堿性淋洗液吸收空氣中的CO?而失效，室溫下可放置7天。

·         碳酸鹽系淋洗液：Na?CO?濃度為5 mmol/L，NaHCO?濃度為2 mmol/L，并加入5%丙酮。準確稱取0.530 g碳酸鈉和0.168 g碳酸氫鈉，溶于適量水中，轉移至1000 mL容量瓶，加入50 mL丙酮，用水定容混勻。

標準溶液：

·         硫氰酸根標準儲備溶液（1000 mg/L） ：將硫氰酸鈉（NaSCN，CAS號：540-72-7，純度≥99.99%）于80℃烘箱內烘干2 h。準確稱取干燥后的硫氰酸鈉0.139 g，用水定容至100 mL。0℃～4℃保存，有效期為6個月。

·         硫氰酸根標準中間溶液（10 mg/L） ：準確吸取1 mL標準儲備溶液，用水稀釋至100 mL。0℃～4℃保存，有效期為1個月。

·         硫氰酸根標準系列工作液：分別取標準中間溶液0 μL、10 μL、20 μL、50 μL、100 μL、500 μL、1000 μL，用水定容至10 mL，濃度分別為0 mg/L、0.01 mg/L、0.02 mg/L、0.05 mg/L、0.10 mg/L、0.50 mg/L、1.00 mg/L。0℃～4℃保存，有效期為1個月。

凈化材料：

·         反相凈化小柱：如OnGuard II RP柱（1.0 mL），或性能相當者。

·         過濾器：水系，0.22 μm。

四、儀器與設備

標準要求配備以下核心設備：

其中，抑制器電導檢測器是該方法的核心檢測部件。抑制器能夠顯著降低淋洗液的背景電導，同時提高待測離子的檢測靈敏度，是實現低濃度硫氰酸根準確檢測的重要保障。

標準提供了兩套儀器參考條件，分別對應氫氧根體系和碳酸鹽體系。檢測人員可根據實驗室儀器配置選擇其中一套。

儀器參考條件Ⅰ（氫氧根體系） ：

儀器參考條件Ⅱ（碳酸鹽體系） ：

五、分析步驟

1. 樣品采集與保存

生乳樣品的采集和保存是保證檢測結果準確性的第一道關口。標準規定：

·         采集的有代表性生乳樣品可用硬質玻璃瓶或聚乙烯瓶盛放

·         樣品采集后應盡快分析

·         若在0℃～6℃冷藏保存，冷藏時間不應超過48 h

·         若不能及時測定，應于-20℃冷凍保存，冷凍時間不應超過30 d

·         解凍溫度不應超過60℃，解凍次數不應超過5次

·         冷藏、冷凍的樣品需恢復至室溫并搖勻，待測

2. 樣品前處理

前處理是該方法的關鍵環節，具體流程如下：

·         稱樣：稱取試樣4 g（精確至0.01 g）

·         蛋白沉淀：用乙腈定容至10 mL，混勻1 min，靜置20 min

·         離心：以8000 r/min離心5 min（4℃）

·         稀釋：準確移取1.00 mL上清液，用水定容至10 mL，混勻

·         凈化柱活化：將反相凈化小柱依次用5 mL甲醇和10 mL水活化，靜置30 min

·         凈化：取上述稀釋液，過0.22 μm濾膜并加裝到活化好的凈化反相柱上，棄去前3 mL流出液，收集后續濾液待測

·         空白試驗：同時做空白試驗

3. 色譜分析

將處理好的樣品溶液注入離子色譜儀，按選定的儀器參考條件進行分離和檢測。

4. 標準曲線繪制

將硫氰酸根標準系列工作液（0 mg/L、0.01 mg/L、0.02 mg/L、0.05 mg/L、0.10 mg/L、0.50 mg/L、1.00 mg/L）分別進樣測定，以濃度為橫坐標、色譜峰面積（或峰高）為縱坐標繪制標準曲線。標準曲線的相關系數應不低于0.99。

5. 定性確認

以硫氰酸根的保留時間定性。試樣溶液中硫氰酸根的保留時間應與標準系列溶液（濃度相當）中硫氰酸根的保留時間一致，相對偏差在±2.5%之內。

6. 定量測定

試樣溶液中待測物的濃度應在標準曲線的線性范圍內。如超出范圍，應將試樣溶液用水稀釋n倍后重新測定。

7. 結果計算

試樣中硫氰酸根的含量以質量濃度w計，數值以毫克每千克（mg/kg） 表示。按以下公式計算：

w = (c × V? × V? × 1000) / (m × V? × 1000) × n

其中：

·         c ——從標準曲線上查得的硫氰酸根質量濃度，mg/L

·         V? ——樣品用乙腈提取時定容體積，mL（本方法為10 mL）

·         V? ——移取離心后上清液的體積，mL（本方法為1.00 mL）

·         V? ——上清液稀釋定容的體積，mL（本方法為10 mL）

·         m ——試樣質量，g（本方法為4 g）

·         n ——超出標準曲線范圍后的稀釋倍數

計算結果保留至小數點后2位，用2次平行測定的算術平均值表示。

特別提示：試樣中測得的硫氰酸根離子含量乘以換算系數1.40，即得硫氰酸鈉含量。

8. 精密度要求

在重復性條件下，2次獨立測試結果與其算術平均值的絕對差值不大于該算術平均值的10% 。

六、關鍵技術要點

1. 乙腈沉淀蛋白——基質凈化的第一步

生乳中含有約3%的蛋白質，直接進樣會導致色譜柱迅速堵塞和污染。標準采用乙腈作為蛋白沉淀劑。乙腈能夠使乳蛋白變性并析出，通過離心將其去除。這一步驟看似簡單，但沉淀是否充分直接影響后續凈化和色譜分析的效果。標準的靜置20 min和8000 r/min離心5 min的參數設置，是基于生乳基質特點經過優化的結果。

2. 反相固相萃取——凈化的雙重保障

蛋白沉淀后的上清液中仍含有脂肪、色素等疏水性雜質。標準采用反相凈化小柱（如OnGuard II RP柱）進行二次凈化。使用前需依次用5 mL甲醇和10 mL水活化，并靜置30 min。活化不充分將直接影響凈化效果，導致雜質進入色譜柱。凈化時棄去前3 mL流出液的操作，是為了避免小柱中殘留的活化溶劑對檢測結果造成干擾。

3. 兩種淋洗液體系——因“機"制宜

標準提供了氫氧根體系和碳酸鹽體系兩套色譜條件。這充分考慮了不同品牌、不同型號離子色譜儀的配置差異。氫氧根體系適用于配備淋洗液發生器的現代離子色譜儀，可實現梯度淋洗，分離效果更優；碳酸鹽體系則適用于傳統手動配制淋洗液的儀器，操作更為直觀。檢測人員可根據實驗室的儀器配置選擇其中一套，無需額外購置設備。

4. 樣品保存條件的嚴格性

硫氰酸根在生乳中可能隨時間發生變化，標準的樣品保存規定極為嚴格：冷藏不超過48 h，冷凍不超過30 d，解凍溫度不超過60℃，解凍次數不超過5次。這些參數是基于硫氰酸根在生乳基質中的穩定性研究制定的，檢測人員應嚴格遵守，否則可能導致檢測結果失真。

5. 硫氰酸根與硫氰酸鈉的換算

標準測定的是硫氰酸根離子（SCN?）的含量，但實際監管中關注的往往是硫氰酸鈉（NaSCN）的添加量。兩者的換算系數為1.40（即硫氰酸鈉的分子量81.07 ÷ 硫氰酸根的式量58.08 ≈ 1.40）。檢測人員在報告結果時需根據監管要求選擇報告硫氰酸根含量還是硫氰酸鈉含量。

七、方法優勢與應用價值

NY/T 3513-2019所規定的離子色譜法具有以下顯著優勢：

1. 針對性強：該標準專門針對生乳這一特定基質進行方法開發和驗證。生乳基質極為復雜，含有蛋白質、脂肪、乳糖、礦物質等多種成分，普通方法難以有效去除干擾。該標準通過乙腈沉淀蛋白和反相固相萃取兩步凈化，有效解決了生乳基質的干擾問題。

2. 靈敏度高：標準的檢出限為0.25 mg/kg，定量限為0.75 mg/kg。這一靈敏度水平能夠滿足生乳中硫氰酸根痕量檢測的需求，有效識別違規添加行為。

3. 選擇性好：離子色譜法利用陰離子交換原理實現硫氰酸根與其他共存陰離子（如氯離子、硝酸根、硫酸根、磷酸根等）的良好分離，有效避免了生乳復雜基質對檢測結果的干擾。

4. 操作規范：標準提供了從樣品采集、保存、前處理到色譜分析的全流程規范，確保了檢測結果的可重復性和可追溯性。

5. 儀器兼容性強：標準提供了兩套色譜條件（氫氧根體系和碳酸鹽體系），適配不同品牌和型號的離子色譜儀，降低了實驗室的方法轉換成本。

6. 填補標準空白：該標準是我國生乳中硫氰酸根測定的專項方法標準，為生乳質量安全監測和風險評估提供了統一的技術依據。

7. 服務監管需求：硫氰酸鈉是生鮮乳質量安全風險監測的重點項目之一。該標準的實施為各級農業農村部門的生鮮乳質量安全監測工作提供了標準化的檢測手段。

八、注意事項

在實際應用中，檢測人員需特別注意以下幾點：

1. 樣品的代表性：生乳批次間可能存在差異，取樣應確保代表性。采集后應盡快分析，嚴格遵守冷藏（≤48 h）和冷凍（≤30 d）的時間限制。

2. 蛋白沉淀的充分性：乙腈沉淀蛋白時，應確保混勻充分（1 min）和靜置時間足夠（20 min）。沉淀不充分可能導致蛋白質進入色譜柱，造成柱壓升高和分離效果下降。

3. 凈化柱的活化：反相凈化小柱使用前必須依次用甲醇和水活化并靜置30 min。活化不充分將直接影響凈化效果。棄去前3 mL流出液的操作不可省略。

4. 用水和試劑質量：必須使用GB/T 6682規定的一級水；乙腈、甲醇、丙酮、50%氫氧化鈉溶液應為色譜純。試劑中的雜質可能影響空白值和檢測結果的準確性。

5. 標準溶液的保存：標準儲備液有效期為6個月，標準中間液和標準工作液有效期為1個月，均需在0℃～4℃條件下保存。

6. 淋洗液的配制：氫氧根系淋洗液可通入氮氣保護，以減緩吸收空氣中的CO?而失效。碳酸鹽系淋洗液需注意丙酮的加入和混勻。

7. 色譜柱的維護：生乳提取液經過凈化后仍可能含有微量殘留雜質，應定期對色譜柱進行再生和維護。發現柱壓升高或分離效果下降時，應及時更換保護柱或清洗色譜柱。

8. 結果報告的單位：標準測定的是硫氰酸根離子含量，如需報告硫氰酸鈉含量，應乘以換算系數1.40。檢測報告應明確標注所報告的是何種形態的含量。

九、總結

NY/T 3513-2019《生乳中硫氰酸根的測定 離子色譜法》以離子色譜-抑制型電導檢測法為核心技術，通過乙腈沉淀蛋白和反相固相萃取兩步凈化策略，為生乳中硫氰酸根的測定提供了一套科學、規范、高靈敏度、高選擇性的分析方法。該標準由農業農村部發布，中國農業科學院北京畜牧獸醫研究所等權威機構參與制定，具有較高的技術權威性。

硫氰酸鈉違規添加是生鮮乳質量安全監管的重點問題之一。該標準的發布和實施，有效統一了生乳中硫氰酸根的檢測方法，為各級農業農村部門的生鮮乳質量安全監測工作提供了標準化的技術手段。標準檢出限低至0.25 mg/kg，定量限為0.75 mg/kg，能夠滿足生乳中硫氰酸根痕量檢測的需求。

對于奶牛養殖企業、乳品加工企業、檢測機構和食品安全監管部門而言，深入理解和正確應用這一標準，不僅是滿足合規要求的必要前提，更是保障生鮮乳質量安全、維護消費者健康權益的重要技術手段。檢測人員應嚴格按照標準規定的操作步驟開展檢測工作，特別注意樣品保存條件、前處理細節和結果換算等關鍵環節，確保檢測結果的準確性和可靠性。隨著我國奶業高質量發展的推進和生鮮乳質量安全監管的日益嚴格，該標準在乳品質量管控中的重要性將進一步凸顯。